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      探針法熒光定量PCR試劑盒實驗過程

      日期:2023-10-09瀏覽:986次

      探針法熒光定量PCR試劑盒實驗過程:

      一、試劑準備

      1. DNA模板

      2.對應目的基因的特異引物(在PCR反應中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據你的模板鏈設計。因此,擴增不同的基因需要設計不同的引物)

      3.10×PCR Buffer

      4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

      5.Taq酶

      二、操作步驟

      1.在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。

          10×PCR buffer             5μl

            dNTP mixl                 4μl

            引物1(10pM)               2μl

            引物2(10PM)              2μ

            Taq酶(2U/μl)            1μl

            DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl

            加ddH2O至               50 μl

         視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。

      2.調整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環30-35次,后在72℃ 保溫7min。

      3.結束反應,PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

      4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測


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